В качестве биологического тест-объекта в работе использовали белых беспородных половозрелых крыс-самок массой 180-200 г. Всего использовано 60 животных. В соответствии с поставленными задачами животные разбивались на группы. Первую (контрольную) группу составили самки, которые потребляли фасованную негазированную питьевую воду «Акваминерале», сбалансированную по содержанию микро- и макроэлементов согласно требованиям СанПина. Вторую (опыт 1) группу составили беременные самки, в качестве питья получавшие питьевую воду «Акваминерале». Третью (опыт 2) группу составили самки, в качестве питья получавшие воду с повышенным содержанием ионов железа, кальция, магния и фтора из центральной системы водоснабжения города Саранска. В четвертую (опыт 3) группу входили беременные крысы, потреблявшие водопроводную воду г. Саранска с повышенным содержанием ионов железа, кальция, магния и фтора.
Эксперимент проводился в летне-осенний период в помещении при температуре 22-25 °С и относительной влажности 67-70%. Животные находились на общем режиме вивария, имели свободный доступ к корму и воде.
Беременность устанавливали, определяя момент спаривания самок, находящихся в состоянии течки. Животные считались беременными с утра того дня, когда во влагалищном содержимом обнаруживали сперматозоиды.
Животные каждой группы забивались на 21-е сутки эксперимента путем декапитации под наркозом эфира с хлороформом с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации, и в соответствии с требованиями правил проведения работ с использованием экспериментальных животных.
Материалом исследования служили кровь и почки белых крыс.
В крови животных с помощью морфологических методов определяли количество эритроцитов и лейкоцитов, концентрацию гемоглобина, скорость оседания эритроцитов. Биохимическими методами в сыворотке крови определяли общее количество белка, креатинина и мочевины.
С целью изучения морфологических изменений в организме животных при потреблении питьевой воды «Акваминерале», водопроводной воды с повышенным содержанием ионов железа, кальция, магния и фтора для исследования брались кусочки почки размером 10Х10 мм. Для гистологического исследования материал фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина. Зафиксированные образцы после промывки в проточной воде подвергали обезвоживанию путем помещения исследуемого материала в спирты возрастающей концентрации и заливали в парафин по общепринятой методике. Готовили гистологические срезы толщиной 7-10 мкм, окрашивали их гематоксилин-эозином по Ван-Гизону и исследовали с помощью цифрового микроскопа Axio Imager.M2 (ZEISS, Япония) с программным обеспечением для анализа изображений AxioVision SE64 Rel. 4.8.3 и ZEN 2011.
При обзорной микроскопии проводили морфологический анализ структурных тканевых компонентов почек, после чего изучали морфометрические параметры: количество телец в поле зрения, шт., площадь почечного тельца, мкм2, площадь почечного клубочка, мкм2, диаметр проксимального извитого канальца, мкм, диаметр просвета проксимального извитого канальца, мкм, площадь эпителиоцитов канальцев почки, мкм2, и площадь их ядер, мкм2.
Статистическая обработка полученных цифровых данных проводилась с помощью программы FStat и Exel. Проверка статистических гипотез осуществлялась по t-критерию Стьюдента. При оценке статистических гипотез в работе принимались следующие уровни значимости: р≤0,05.
Проведенные морфологические и биохимические исследования показали (табл. 1), что в крови беременных животных, потреблявших воду «Акваминерале», по сравнению с небеременными (контроль) обнаружено увеличение количества эритроцитов на 12,8% (P ≤ 0,05), гемоглобина - на 8,9%, лейкоцитов - на 29,6% (P ≤ 0,05), СОЭ - на 13,3% (P ≤ 0,05), что, вероятнее всего, объясняется физиологическим ответом организма на стимуляцию обмена веществ при беременности.
Снижение концентрации общего белка на 13,3% (P ≤ 0,05) и креатинина в сыворотке крови - на 37,5% (P ≤ 0,05) у беременных крыс (табл. 1) происходит вследствие увеличения объема крови, повышения почечного плазмотока и фильтрации.
Сравнительное исследование крови небеременных крыс (опыт 2), получавших воду г. Саранска, по сравнению с показателями небеременных контрольных крыс показало, что достоверных отличий (P≤0,05) нет, кроме увеличения СОЭ.
Однако показатели крови у беременных крыс (опыт 3) иные. По сравнению с контролем у беременных крыс, потреблявших водопроводную воду г. Саранска (опыт 3), происходит достоверное увеличение эритроцитов на 30,5% (P≤0,05), лейкоцитов - на 51,01% (P≤0,05), гемоглобина - на 21,8%, СОЭ - на 366,7% (P≤0,05), мочевины - на 17,64% (P≤0,05), креатинина- на 37,5% (P≤0,05). Количество общего белка уменьшилось на 21,2% (P≤0,05).
Таблица 1
Показатели крови белых крыс при потреблении воды «Акваминерале» и водопроводной воды г. Саранска с повышенным содержанием ионов железа, кальция, магния и фтора
|
Показатели |
Контроль |
Опыт 1 |
Опыт 2 |
Опыт 3 |
|
Общее количество эритроцитов (×1012/л) |
4,52±0,01 |
5,10±1,06 |
4,90±0,08 |
5,90±0,51* |
|
Общее количество лейкоцитов (×109/л) |
5,90±0,30 |
7,65±0,55* |
6,10±0,05 |
8,91±0,94* |
|
Концентрация гемоглобина (г/л) |
101,00±9,16 |
110,00±10,80 |
110,02±9,28 |
123,00±9,90* |
|
СОЭ (мм/ч) |
1,50±0,08 |
1,70±0,50 |
2,00±0,01* |
5,50±0,94* |
|
Количество общего белка (г/л) |
39,00±3,28 |
34,50±3,05 |
36,80±3,29 |
32,20±2,71 |
|
Содержание мочевины (ммоль/л) |
5,10±0,76 |
5,05±0,50 |
5,60±0,15 |
6,00±0,09 |
|
Содержание креатинина (моль/л) |
0,08±0,008 |
0,05±0,001* |
0,09±0,002 |
0,11±0,043* |
Примечание * - P ≤ 0,05 по сравнению с контрольными животными.
Повышение таких биохимических показателей, как уровень креатинина и мочевины в сыворотке крови беременных животных, потреблявших водопроводную воду г. Саранска, может указывать на дисфункцию почек и может оцениваться как ранний признак почечной недостаточности.
Гистологические исследования почек крыс контрольной группы показали, что паренхима почек сохранена. Хорошо прослеживалось корковое и мозговое вещество. Почечные клубочки, окруженные капсулой Боумена-Шумлянского, имеют четкие границы. Проксимальные и дистальные извитые канальцы выстланы кубическим эпителием, содержащим крупные ядра. В просвете почечных канальцев содержимое отсутствует.
При потреблении беременными крысами питьевой воды «Акваминерале» (опыт 1) достоверных отличий от контроля как в гистологической, так и морфометрической картине почек не обнаружено.
Гистологические исследования коркового вещества почек небеременных крыс, получавших водопроводную воду с повышенным содержанием ионов железа, кальция, магния и фтора (опыт 2), обнаружили незначительное расширение капилляров почечных клубочков, их полнокровие. Гистологическая структура проксимальных извитых канальцев сохранена.
Морфометрические исследования показали, что в данной опытной группе (опыт 2) по сравнению с контролем площадь почечного тельца, площадь его клубочка превышают показатели контрольной группы соответственно на 9,98 и 10,66%. Количество почечных телец в поле зрения уменьшается по сравнению с контролем на 4,97%. Диаметр проксимального извитого канальца и его просвета, площадь эпителиоцита и его ядра по сравнению с контролем достоверно не изменяются (табл. 2).
Таблица 2
Морфометрические показатели строения почек белых крыс, потреблявших воду «Акваминерале» и водопроводную воду с повышенным содержанием ионов железа, кальция, магния и фтора
|
Показатели |
Контроль
|
Опыт 1
|
Опыт 2
|
Опыт 3
|
|
Количество телец в поле зрения, шт. |
10,25±1,18 |
9,80±1,17 |
9,74±1,06
|
8,90±1,01* |
|
Площадь почечного тельца, мкм2 |
5849,03±193,65
|
6689,48±321,0* |
6430,90±201,25 |
7060,27±178,14* |
|
Площадь почечного клубочка, мкм2 |
4079,71±159,16
|
4375,05±149,50 |
4494,26±154,52
|
5057,33±194,46* |
|
Диаметр проксимального извитого канальца, мкм |
32,28±2,60
|
33,09±2,65
|
33,07±1,81
|
35,50±2,87*
|
|
Диаметр просвета проксимального канальца, мкм |
11,93±1,52
|
12,45±0,57
|
12,01±0,30
|
10,87±0,49*
|
|
Площадь эпителиоцита, мкм2 |
109,46±2,26
|
117,47±3,27
|
113,82±3,30
|
124,63±10,70 |
|
Площадь ядра эпителиоцита, мкм2 |
31,15±2,89
|
30,18±2,70
|
31,97±2,08*
|
25,89±2,78* |
Примечание: *Р≤0,05 по сравнению с животными контрольной группы.
Гистологические изменения почек беременных самок, получавших водопроводную воду (опыт 3), характеризовались формированием гипертрофии клубочков, в которых капиллярные петли расширены, полнокровны. Гистологическая структура канальцев сохранена. Некрозы канальциевого эпителия отсутствуют.
При сравнении показателей морфометрии почечных структур беременных крыс, потреблявших водопроводную воду (опыт 3), с показателями контрольной группы животных выявлено уменьшение количества почечных телец в поле зрения на 13,13% (Р≤0,05), увеличение площади почечных телец и почечных клубочков на 20,70% (Р≤0,05) и 23,98% (Р≤0,05), диаметра проксимального извитого канальца на 10,62%, при этом наблюдается сужение просвета его канальца на 10,12%. Также по сравнению с контрольными животными выявлено увеличение средней площади эпителиоцитов проксимального извитого канальца на 9,49%, уменьшение площади ядра на 16,88% (Р≤0,05).
Таким образом, в результате исследования выявлено, что вода г. Саранска с повышенной жесткостью не оказывает значительного влияния на показатели крови небеременных крыс, в то же время при длительном применении выявляется неспецифическое действие на показатели крови беременных животных.
Длительное использование питьевой воды с повышенным содержанием ионов железа, кальция, магния и фтора беременными самками приводит к качественным изменениям на клеточно-тканевом уровне почек, что проявляется в виде снижения количества почечных телец, увеличения площади почечного тельца и площади почечного клубочка.
Работа проводилась при финансовой поддержке Минобрнауки РФ в рамках государственного задания ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный педагогический институт имени М.Е. Евсевьева» (проект «Влияние антропогенных факторов на морфофункциональное состояние организма»).
Рецензенты:
Федотова Г.Г., д.б.н., профессор кафедры теории и методики физической культуры и спорта ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный педагогический институт имени М.Е. Евсевьева», г. Саранск.
Власова В.П., д.б.н., профессор кафедры теории и методики физической культуры и спорта ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный педагогический институт имени М.Е. Евсевьева», г. Саранск.