Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Введение

Лечение опухолей серозных полостей (как первичных, так и метастатических) является одной из наиболее сложных проблем онкологии. Это связано как с клиническими особенностями данного вида опухолей, так и со спецификой их реакции на химиотерапию. Как правило, опухолевое поражение серозных оболочек вызывает быстрое накопление жидкости в соответствующей полости, которое, несмотря на относительно небольшое число опухолевых клеток, вызывает органную дисфункцию и выраженные белковые потери [6]. Возможности системной химиотерапии при данном виде патологии существенно ограниченны, поскольку большинство химиопрепаратов при внутривенном введении плохо проникают в выпот [6; 9]. Основным методом лечения остается внутриполостное введение химиопрепаратов - (внутриполостная химиотерапия - ВПХТ). Одной из главных проблем внутриполостной химиотерапии является быстрое всасывание лекарства в системный кровоток. Решением данной проблемы может стать создание препаратов, конъюгированных с макромолекулами, обеспечивающими постепенное замедленное высвобождение действующего вещества. В настоящее время целый ряд подобных препаратов уже проходит клинические испытания (нанодисперсные и конъюгированные с полимерами формы паклитаксела, митомицина, 5-фторурацила и др. [10-12]). Еще большее количество композиций находятся на стадии доклинических исследований. Основной особенностью наноструктурированных препаратов является замедленное высвобождение действующего компонента. Это позволяет, во-первых, значительно увеличить концентрацию и пролонгировать время нахождения препарата в очаге, а во-вторых - избежать резких подъемов плазменной концентрации, которые являются причиной многих побочных эффектов [5]. Одним из перспективных препаратов данного класса, является, на наш взгляд, Проспидин-гидрогель (совместная разработка НИИ Физико-химических проблем БГУ, Минск, и ООО «Биотехнологическая компания ТНК», Москва [1; 8]. Он представляет собой иммобилизованную на фосфате декстрана форму проспидина. Проспидин-гидрогель обладает оптимальным для ВПХТ набором свойств благодаря особенностям образующих компонентов.

Действующее вещество композиции - противоопухолевый препарат проспидин (γ-хлор-β-оксипропил-N, N´´ диспиротрипиперазиния дихлорид). Проспидин относится к алкилирующим соединениям, основной механизм действия которых связан с взаимодействием с молекулой ДНК и/или РНК. Особенностью противоопухолевого действия проспидина является то, что он не вызывает токсической деструкции клеток. Препарат проспидин используется для лечения большого количества опухолей различных локализаций, хотя и демонстрирует разную степень активности. Последнее связано с особенностью фармакокинетики препарата. При парентеральном ведении препарат метаболизируется в печени с образованием неактивных метаболитов. Кроме того, быстрое выведение субстанции проспидина из организма с мочой препятствует достижению его максимального лечебного действия.

В качестве носителя использован фосфат декстрана (ФД) - производное декстрана, в котором путем этерификации часть гидроксильных групп полисахарида замещена фосфорнокислыми группами. ФД содержит функциональные группы (PO(OH)₂, CO(NH)₂)₂, способные связывать проспидин путем ионных и донорно-акцепторных взаимодействий. Молекулярная масса фосфата декстрана составляет около 60 кД, что обеспечивает длительную циркуляцию готового лекарственного препарата в кровяном русле и постепенное высвобождение конъюгированной с полимером действующей субстанции. Преимуществами ФД с медицинской точки зрения являются его полная биосовместимость, низкая токсичность и отсутствие антигенных свойств.

Работы, в которых исследована эффективность проспидин-гидрогеля, на сегодняшний день единичны [2; 3], поэтому имеется потребность в более подробном изучении данного препарата (в частности, оценки влияния на различные показатели гомеостаза, механизм развития побочных эффектов и т.д.). Решение этих вопросов и стало основным содержанием настоящей работы.

Цель работы: исследование противоопухолевой активности и системной токсичности проспидина, конъюгированного с фосфатом декстрана, в сравнении с водорастворимой формой препарата.

Материалы и методы

Исследования выполнены на 140 белых лабораторных крысах массой 190-230 г. Штамм гепатомы перевивали путем внутрибрюшинной инъекции 0,5 мл нативной асцитической жидкости, полученной от животного-опухоленосителя на 5-е сутки после перевивки. В исследовании использованы препараты: Проспидин (ФГУП «Микроген», Россия) и Проспидин-гидрогель (НИИ Физико-химических проблем БГУ, Белоруссия). Препараты вводили внутрибрюшинно через 24 часа после перевивки опухоли. Для каждого из препаратов исследована эффективность трех дозировок: 150, 450 и 1350 мг/кг. Оценка эффективности и безопасности препаратов проводилась в 2-х сериях экспериментов. В серии А животных наблюдали в течение 30 дней либо до момента гибели, в серии В - в течение 5 суток. У животных в серии А оценивали: общую летальность, летальность от прогрессирования опухоли, частоту полного излечения, продолжительность жизни павших животных. У животных в серии В исследовали характеристики асцитической жидкости, а также морфологические и биохимические показатели периферической крови. Для асцитической жидкости определяли: объем, индекс массы асцита (отношение массы асцита к массе тела животного, выраженное в процентах), число клеток гепатомы в единице объема асцита, концентрацию общего белка, количество эритроцитов и лейкоцитов. Анализ периферической крови включал в себя следующие показатели: количество эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов, гемоглобин. Анализ крови выполняли на гематологическом анализаторе ABX Micros 60 (Horiba ABX Diagnostics Inc, France). Биохимический анализ крови включал определение общего белка, глюкозы, мочевины, креатинина, билирубина, аланиновой и аспарагиновой трансаминаз (АлТ и АсТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ). Биохимические показатели определяли на анализаторе Humalyzer 3000 (Human GmbH, Германия).

Схема рандомизации животных представлена в таблице 1.

Таблица 1.

Принципы рандомизации экспериментальных животных

Результаты исследования обработаны статистически с использованием t-критерия Стьюдента и критерия Хи-квадрат. Различия сравниваемых показателей считали достоверными при p<0,05.

Результаты и их обсуждение

Результаты исследования противоопухолевой активности проспидина представлены в таблицах 2 и 3. При их анализе установлено, что проспидин оказывал дозозависимый противоопухолевый эффект, причем эффективность «чистой» и наноструктурированной форм препарата существенно различалась.

Таблица 2.

Показатели эффективности химиотерапии (серия А)

Примечание: ¹ - показатель достоверно отличается от аналогичного в контрольной группе; ² - достоверное отличие показателя в группе, получавшей проспидин-гидрогель, от такового в группе, получавшей эквивалентную дозу водорастворимого препарата

Таблица 3.

Характеристика асцитической жидкости на фоне различных схем химиотерапии (серия B)

Примечание: 1 - показатель достоверно отличается от аналогичного в контрольной группе; 2 - достоверное отличие показателя в группе, получавшей проспидин-гидрогель, от такового в группе, получавшей эквивалентную дозу водорастворимого препарата

При введении водного раствора проспидина в дозе 150 мг/кг антибластомная эффективность была относительно низкой. В серии А экспериментов (наблюдение до момента гибели или выздоровления) ни у одного из животных препарат не прерывал развитие гепатомы (летальность в группе составила 100%), но тормозил ее прогрессирование. Продолжительность жизни животных увеличилась в 1,4 раза по сравнению с контролем. Причиной смерти всех животных стало прогрессирование опухоли. В серии B экспериментов (наблюдение в течение 5 суток) также отмечена 100%-ная приживаемость опухоли. Однако объем асцитической жидкости и количество опухолевых клеток в единице объема асцита были достоверно ниже, чем в контроле (на 34 и 50% соответственно). По другим исследованным показателям асцитическая жидкость в данной группе не отличалась от таковой в контроле.

Доза проспидина в 450 мг/кг по противоопухолевому эффекту значимо превосходила вышеописанную. В серии А выжило 4 из 10 (40%) животных. Продолжительность жизни павших животных была на 84% выше, чем в 1-й опытной, и на 159% выше, чем в контрольной группе. Причиной смерти всех животных, так же как и в 1-й опытной группе, стало прогрессирование гепатомы. В серии В экспериментов опухоль развилась у 7 из 10 животных. У опухоленосителей степень развития гепатомы была достоверно меньшей по сравнению с нелеченными животными и животными, получавшими препарат в дозе 150 мг/кг. Число опухолевых клеток в единице объема асцита составило 20% от такового в контроле и 40% от аналогичного показателя 1-й опытной группы. Регистрировались также достоверно более низкие показатели объема асцитической жидкости и содержания белка в ней.

Введение проспидина в дозе 1350 мг/кг обеспечивало выраженный противоопухолевый эффект, но вместе с тем сопровождалось побочными и токсическими реакциями. У животных I серии летальность, как и при введении препарата в дозе 450 мг/кг, составила 60%, однако опухоль была обнаружена только у 3 из 6 умерших крыс. Причиной смерти 3 животных явилось общетоксическое действие препарата. Продолжительность жизни умерших крыс в данной группе была выше, чем в контрольной, но ниже, чем в 1-й и 2-й опытных группах. Уменьшение продолжительности жизни было связано с ранней гибелью животных, павших от интоксикации (все три крысы погибли на 2-е сутки после введения препарата). При использовании дозы 1350 мг летальные исходы отмечались и в серии B эксперимента. Как и в серии А, у погибших животных не было обнаружено признаков роста гепатомы. Среди выживших опухоль была выявлена у 4 крыс. В описываемой группе степень развития опухоли на момент выведения животных из эксперимента была наименьшей. Число клеток гепатомы в асцитической жидкости почти на порядок ниже, чем в 1-й и 2-й опытной группах, и более чем в 40 раз ниже по сравнению с контролем. Объем асцита составил 22, 37 и 52% по отношению к контрольной, 1-й и 2-й опытным группам соответственно.

Эквивалентные дозы проспидин-гидрогеля оказывали более выраженный противоопухолевый эффект по сравнению с водорастворимым препаратом.

У животных, получавших проспидин-гидрогель в дозе 150 мг/кг, в серии A экспериментов в 30% случаев было зарегистрировано полное излечение. Продолжительность жизни особей с прижившейся опухолью была выше, чем контроле, но лишь ненамного превосходила аналогичный показатель в группе с эквивалентной дозой чистого проспидина (9,1±0,5, 5,6±0,3 и 7,9±0,6 соответственно). По другим показателям существенных различий между 1b и 4b опытными группами зарегистрировано не было.

Доза проспидин-гидрогеля в 450 мг/кг оказалась наиболее эффективной и безопасной. В серии А экспериментов летальность составила 30% (против 60% в группе с аналогичной дозой чистого проспидина). Продолжительность жизни носителей опухоли составила 17,7±0,6 сут., что на 22% выше, чем у животных 2а опытной группы. В серии В эксперимента летальных исходов не отмечалось, опухоль развилась у 4 из 10 крыс. Степень развития гепатомы была значительно меньшей, чем во 2-й опытной группе, и близка к таковой в 3-й контрольной группе (чистый проспидин в дозе 600 мг/кг). Так, количество клеток гепатомы в асцитической жидкости составило 0,042±0,003 х 10⁹/л (1% и 5% от значений аналогичного показателя в контроле и в группе, получавшей эквивалентную дозу водного раствора проспидина соответственно).

В 6-й опытной группе (проспидин/гидрогель в дозе 1350 мг/кг) регистрировалась наиболее высокая летальность. В серии A экспериментов погибло 7 из 10 крыс. Все они пали на 2-3 сутки после введения препарата при явлениях энтероколита либо кишечной непроходимости. У животных отмечалась вялость, адинамия, рвота, отказ от воды и пищи. На секции в брюшной полости обнаружены инфицированные остатки коллоида проспидина и гиперемированные раздутые петли кишечника. Признаков роста гепатомы не выявлено. У выживших животных также не обнаружено признаков опухолевого роста. Во серии В пало 6 крыс, причем механизм наступления смерти был аналогичен таковому в серии А. Из 4 животных, доживших до окончания эксперимента, гепатома развилась лишь у одного.

Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали, что противоопухолевый эффект проспидина возрастает с увеличением дозы от 150 до 1350 мг/кг. При этом доза 150 мг/кг наименее эффективна с точки зрения подавления развития гепатомы, а доза 1350 мг/кг сопровождается общетоксическими реакциями, которые сами по себе могут служить причиной летальных исходов. Оптимальной по соотношению эффективность/токсичность является доза проспидина 450 мг/кг.

Проспидин-гидрогель, вводимый внутрибрюшинно через 24 часа после перевивки АГЗ, оказывает более выраженный ингибирующий эффект на рост гепатомы по сравнению с «чистым» препаратом. Эквивалентная по эффективности доза наноструктурированной формы препарата приблизительно в 2 раза ниже аналогичной дозы чистого проспидина. Доза препарата, обеспечивающая наиболее высокую опухоль-ингибирующую активность при наименьшем количестве побочных реакций, составляет 450 мг/кг. Увеличение дозы до 1350 мг/кг приводит к развитию специфических осложнений, обусловленных неполной резорбцией коллоида из брюшной полости, - кишечной непроходимости и энтероколита. Эти осложнения развиваются в 60-70% случаев после введения препарата и заканчивается летально.

Результаты исследования влияния различных доз проспидина на клеточный состав и биохимические показатели периферической крови приведены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4.

Морфологические показатели периферической крови животных (серия B)

Примечание: жирным шрифтом выделены показатели, достоверно (p<0,05) отличающиеся от аналогичных на исходном этапе (внутри группы).

Таблица 5.

Биохимические показатели периферической крови животных (серия B)

Примечание: жирным шрифтом выделены показатели, достоверно (p<0,05) отличающиеся от аналогичных на исходном этапе (внутри группы).

У нелеченных животных развитие АГЗ приводило к анемии и умеренно выраженному лейкоцитозу. Кроме того, отмечалось снижение общего белка сыворотки. Биохимические показатели, характеризующие функциональное состояние почек (мочевина, креатинин) и печени (билирубин, АлТ, АсТ, щелочная фосфатаза), значимо не изменялись.

У животных, получавших чистый проспидин в дозе 150 мг/кг, достоверных изменений исследованных показателей по сравнению с контрольной группой не зарегистрировано.

При введении проспидина в дозе 450 мг/кг выраженность анемии была меньшей, чем в контрольной и 1b опытной группах. Кроме того, отмечалась тенденция к лейко- и тромбоцитопении. Уровень общего белка и биохимические показатели крови оставались в рамках референсных значений.

В группе крыс, получавших проспидин в дозе 1350 мг/кг, лейко- и тромбоцитопения были значительно более выраженными, отмечалось увеличение уровня мочевины, креатинина и АЛТ без достоверного роста билирубина и щелочной фосфатазы.

Проспидин в форме гидрогеля оказывал меньшее влияние на показатели гомеостаза, чем его чистая форма. Кроме того, следует отметить, что в связи меньшей степенью прогрессирования гепатомы явления опухолевой интоксикации у животных 4b-6b групп проявлялись не так ярко, как в группах, получавших чистый препарат. Так, у всех крыс этих групп степень снижения гемоглобина и общего белка составила 5-10% (в группах 4а-6а - 15-20%), а биохимические показатели сыворотки практически не изменялись. Лейкопения и тромбоцитопения регистрировались лишь у выживших крыс в 6b группе и были выражены меньше, чем в группе 6а.

Таким образом, наиболее ранними проявлениями общетоксических эффектов проспидина являются гематологические реакции в виде лейко- и тромбоцитопении, причем эти изменения регистрируются при введении чистого проспидина в дозе 450 мг/кг и проспидин-гидрогеля в дозе 1350 мг/кг. Кроме того, чистый проспидин в дозе 1350 мг/кг вызывает явления нефро- и гепатопатии в виде увеличение уровня мочевины, креатинина и аланиновой трансаминазы.

Полученные результаты согласуются с данными других авторов, продемонстрировавших дозозависимый эффект проспидина при перевиваемых опухолях, а также более высокую активность конъюгированной с фосфатом декстрана формы препарата при внутриполостном введении [2; 3]. Наиболее вероятной причиной повышения эффективности препарата является изменение его кинетики: коллоидный фосфат декстрана замедляет всасывание проспидина в системный кровоток и значительно увеличивает его экспозицию в зоне опухолевого поражения [1]. Вместе с тем увеличение объема коллоидного раствора, вводимого в брюшную полость, выше определенного критического значения вызывает явления энтероколита и кишечной непроходимости, что лимитирует максимальную дозу препарата. Полученные результаты могут служить отправной точкой для разработки режимов дозирования проспидин-гидрогеля при полостных опухолях у человека.

Выводы

1. Проспидин оказывает дозозависимый противоопухолевый эффект при внутрибрюшинном введении у крыс с трансплантированной асцитной гепатомой Зайдела.
2. Проспидин, конъюгированный с фосфатом декстрана, превосходит растворимый препарат в 2-3 раза. Оптимальной дозой как растворимого проспидина, так и проспидин-гидрогеля, является доза в 300 мг/кг.
3. Типичными побочными эффектами растворимого проспидина при введении в дозе 1350 мг/кг являются угнетение кроветворения и гепато- и нефропатия, а проспидин-гидрогеля - энтероколит и кишечная непроходимость. Последние, вероятно, обусловлены местным воздействием комплекса проспидин - фосфат декстрана на органы брюшной полости.

Авторы выражают благодарность профессору Иванову В.А. (НИИ цитологии, Санкт-Петербург) за любезно предоставленный штамм опухоли и помощь в выполнении работы.

Рецензенты:

Инчина В.И., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой фармакологии с курсом клинической фармакологии ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарёва» Минобрнауки России, г.Саранск.

Котляров А.А., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой внутренних болезней Обнинского ИАТЭ НИЯУ «МИФИ» Минобрнауки России, г.Саранск.