Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,737

VALIDATION OF HPLC-PROCEDURES FOR ANALYSIS OF AN EXPERIMENTAL DRUG «REMELTOP»

Vorobeva V.M. 1 Makarova O.G. 1
1 The Altai State Medical University
Выполнена валидация ВЭЖХ-методики качественного и количественного анализа метилурацила и метронидазола в составе экспериментального препарата «Ремелтоп». Исследования проведены на жидкостном хроматографе LC-20 фирмы «SHIMADZU» (Япония) с УФ-детектором, с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с использованием программы «LCsolution version 1.4». Неподвижная фаза – хроматографическая колонка 4,6×150 мм PerfectChrom C-18, размер частиц 5 нм («MZ-Analysentechnik», Германия). Подвижная фаза – А: трифторуксусная кислота раствор 0,1 %, Б: ацетонитрил 100 %. Температура колонки – 35 °С, скорость подачи элюента – 100 мкл/мин, объем пробы – 20 мкл, градиентное элюирование – изменение концентрации элюента Б от 10 % до 50 %, продолжительность анализа – 8 мин. Разработанная методика качественного и количественного анализа метилурацила и метронидазола методом ВЭЖХ может быть использована для оценки качества экспериментального препарата «Ремелтоп», порошка для приготовления суспензии для приема внутрь, так как экспериментальным путем установлены параметры линейности (R2=0,9991 при y=233600×x-19,458; R2=0,9993 при y=7490576×x+0,246), диапазона применения (от 50 до 150 %), прецизионности в условиях повторяемости (RSD = 0,50 %; 1,04%), правильности ( =95,52±0,56%, 99,96±0,16 %) для метилурацила и метронидазола соответственно, которые не превышают рекомендуемых значений.
Validation HPLC-methods of qualitative and quantitative analysis of methyluracile and metronidazole in the structure of the experimental drug, «Remeltop» was performed. In liquid chromatograph LC-20 of the company «SHIMADZU» (Japan) with UV detector with further computer processing of the results of research using the program «LCsolution version 1.4» studies were conducted. Stationary phase - chromatography column 4,6 x 150 mm PerfectChrom C-18, a particle size of 5 nm («MZ-Analysentechnik», Germany). The mobile phase: trifluoroacetic acid a solution of 0.1%, B: acetonitrile 100%. Gradient elution concentration changes of eluent B from 10% to 50%, duration of the analysis 8 min. The technique for quality assessment Remeltop (a powder for oral suspension) can be used, as experimentally defined settings linearity (R2=0,9991, y=233600×x-19,458; R2=0,9993, y=7490576×x+0,246), application range (50 to 150%), precision in terms of the frequency of occurrence (RSD=0,50%; 1,04%; 1,75%), correctness ( =95,52±0,56%, 99,96±0,16%) for methyluracile and metronidazole respectively, which do not exceed the recommended values.
validation
quantification
HPLC
Remeltop (a powder for oral suspension)

Введение

Составной частью комплексного лечения ожогов пищевода является местная терапия, которая должна проводиться в соответствии с фазами развития патологического процесса. Сотрудниками кафедр фармацевтической технологии и детской хирургии АГМУ для местной терапии химических ожогов пищевода разработаны и запатентованы мукоадгезивные композиции на основе производного целлюлозы в форме геля для перорального приема. С целью увеличения срока годности и возможности промышленного производства составы получены в форме «сухих суспензий» – однородных смесей лекарственных веществ со стабилизаторами, к которым добавляют необходимое количество растворителя непосредственно перед применением. Препараты получили условные названия «Премелтоп» (применение в фазу воспаления) и «Ремелтоп» (применение в фазу грануляций) [1,3].

При подготовке нормативной документации (ФСП, регламенты) на экспериментальный препарат «Ремелтоп» была разработана методика анализа лекарственных веществ, входящих в состав препарата, методом ВЭЖХ.

Цель данной работы – проведение валидационных исследований ВЭЖХ-методики качественного и количественного анализа экспериментального препарата «Ремелтоп».

Материалы и методы исследования

Объект исследования – порошок для приготовления суспензий для приема внутрь: «Ремелтоп» по 7,5 г (в 100,0 готовой к применению суспензии: метилурацила (ФС 42-0256-07) 2,0; метронидазола (ФС 42-0257-07) 0,75; регенкура (ФС 42-3395-97) 4,0; ароматизатора, идентичного натуральному 0,5, натрия сахарината (ФС 42-1826-82) Е 954 0,24) для применения в фазу грануляций и формирования рубца.

Экспериментальные исследования проведены на жидкостном хроматографе LC-20 фирмы «SHIMADZU» (Япония) с УФ-детектором, с последующей компьютерной обработкой результатов с использованием программы «LCsolution version 1.4». Неподвижная фаза – хроматографическая колонка 4,6×150 мм PerfectChrom C-18, размер частиц 5 нм («MZ-Analysentechnik», Германия). Подвижная фаза – А: трифторуксусная кислота (ТФУК) раствор 0,1 %, Б: ацетонитрил 100 %. Температура колонки – 35 °С, скорость подачи элюента – 100 мкл/мин, объем пробы – 20 мкл, градиентное элюирование – изменение концентрации элюента Б от 10 % до 50 %, продолжительность анализа – 8 мин.

Методика. Около 0,05 (точная навеска) порошка помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл и обрабатывали смесью ацетонитрил-вода в соотношении (1 : 9), перемешивали в течение 5 минут, доводили объем раствора до метки тем же растворителем. Центрифугировали в течение 10 минут и фильтровали через бумажный фильтр. Полученный фильтрат вводили в колонку хроматографа как анализируемую пробу. Для приготовления элюентов использовали ацетонитрил для хроматографии «Сорт 1» («Криохром», Россия), ТФУК марки «ч.д.а» («ВЕКТРОН») и воду очищенную, полученную на установке для получения воды аналитического качества «УПВА-5».

Результаты исследования и их обсуждение

Согласно современным рекомендациям ICH и ведущих фармакопей методика количественного определения должна быть валидирована по основным характеристикам, таким как специфичность (specificity), линейность (linearity), правильность, или истинность (accuracy, or trueness), прецизионность (precision) [5,6,7,8].

Специфичность методики. При проведении исследования установлено (рис. 1), что время удерживания метилурацила составляет 2,44 мин, метронидазола 4,03 мин, на хроматограмме пики определяемых веществ хорошо разделены между собой, пики примесей из растворителя, вспомогательных веществ и основы лекарственной формы не мешают их определению.

Рис. 1. Хроматограмма фильтрата состава «Ремелтоп»,

(1 – метилурацил (2,44 мин), 3 – метронидазол (4,03 мин), 2,4 – вспомогательные вещества (2,82 и 7,10 мин))

Из данных, представленных в табл. 1, видно, что спектральные отношения анализируемых веществ идентичны соответствующим спектральным отношениям стандарта. Времена удерживания метилурацила и метронидазола не существенно отличается от времени удерживания соответствующих веществ стандарта и не превышают нормы, указанной в технической документации прибора (0,5 %).

Таблица 1

Времена удерживания и спектральные отношения компонентов состава «Ремелтоп»

 

Компоненты

Проба

Стандарт

 

Стандартное отклонение, %

Время удерживания, мин

А270 / А220

Время удерживания, мин

А270 / А220

Метилурацил

2,44

0,471

2,42

0,471

0,014

Метронидазол

4,03

1,305

4,09

1,305

0,042

Пригодность хроматографической системы. Расчет параметров пригодности хроматографической системы оценивали путем последовательного шестикратного введения растворов анализируемых веществ в хроматограф и регистрации хроматограмм. Полученные результаты позволяют оценить параметры хроматографической системы как удовлетворительные (табл. 2 и 3) и сделать заключение о пригодности используемой хроматографической системы для анализа экспериментального препарата «Ремелтоп».

Таблица 2

Характеристики пригодности хроматографической системы

 

Компоненты

Коэффициент ассиметрии пика, Т

Коэффициент разделения пиков, Rs

Эффективность хроматографической колонки т.т., N

Метилурацил

1,84

2,97

1385

Метронидазол

1,42

3,24

3529

Рекомендуемые значения

Т ≤ 2,0

Rs > 2,0

N ≥ 1000

Таблица 3

Критерий воспроизводимости площадей пиков

№ п/п

Метилурацил

Метронидазол

1

14131262

7106568

2

14141831

7212533

3

14145876

7188526

4

14124236

7112995

5

14151220

7188456

6

14174663

7214421

Sср

14144848

7170583,5

SD

17601,87

48450,52

RSD ≤ 2,0 %

0,12

0,68

Линейность методики исследовали на 5 уровнях концентрации от теоретического содержания лекарственных веществ в препарате в диапазоне концентраций от 50 до 150 % от номинального значения. Коэффициент корреляции линейного регрессивного графика составил для метилурацила 0,9991 при y=233600×x-19,458 (рис. 2), для метронидазола 0,9993 при y=7490576×x+0,246 (рис. 3).

y = 233600x – 19,458

R2 = 0,9991

Рис. 2. Линейность методики определения метилурацила

y = 7490576x +0,246

R2 = 0,9993

Рис. 3. Линейность методики определения метронидазола

Диапазон экспериментальных данных, удовлетворяющих линейной модели, в интервале концентраций от 50 до 150 % можно рассматривать как аналитическую область методики.

Параметр «прецизионность аналитической методики» включает в себя повторяемость, промежуточную прецизионность и воспроизводимость. При оценке повторяемости методики (табл. 5) установлена величина относительного стандартного отклонения для метилурацила 0,50 %; для метронидазола 1,04 %, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости.

Таблица 5

Определение повторяемости разработанной методики

Повторность

Концентрация вещества в 1,0 г порошка для суспензий, мг

Метилурацил

Метронидазол

1

265,88

100,81

2

267,74

100,22

3

267,04

98,23

4

266,56

100,88

5

264,20

99,87

6

264,91

99,03

Среднее значение

266,06

99,83

RSD ≤ 2,0%

0,50

1,04

Оценку правильности методики проводили по результатам анализа модельных составов экспериментального препарата на четырех уровнях содержания действующих веществ 50, 80, 100 и 120 %. Критерием приемлемости является средний процент восстановления (отклик) при использовании растворов заданных концентраций, скорректированных на 100 %, и его средняя величина должна находиться в пределах 100±5 % (табл. 6).

Таблица 6

Определение правильности методики

Метилурацил

Метронидазол

содержание, мг в 1г порошка

Отклик,

%

содержание, мг в 1г порошка

Отклик,

%

Ожидаемое

Полученное

Ожидаемое

Полученное

133,60

130,56

97,73

50,20

49,89

99,39

133,60

130,84

97,94

50,20

50,09

99,77

133,60

132,29

99,02

50,20

50,27

100,14

213,60

213,16

99,79

80,20

80,50

100,37

213,60

213,84

100,11

80,20

80,05

99,81

213,60

213,96

100,17

80,20

80,27

100,09

267,00

265,17

99,31

100,20

100,09

99,89

267,00

265,91

99,59

100,20

100,10

99,90

267,00

267,22

100,08

100,20

100,25

100,05

320,40

320,83

100,13

120,20

120,10

99,91

320,40

321,56

100,36

120,20

120,25

100,04

320,40

320,34

99,98

120,20

120,31

100,09

Среднее значение выхода –

95,52 %

99,96 %

Среднее значение выхода составило для метилурацила 95,52±0,56 %, для метронидазола 99,96±0,16 %, и не превысило рекомендуемых значений.

Таким образом, согласно результатам проведенных исследований, разработанная ВЭЖХ-методика качественного и количественного определения метилурацила и метронидазола в составе экспериментального препарата «Ремелтоп» позволяет объективно оценить качество многокомпонентной лекарственной формы. Полученные результаты включены в ФСП и Лабораторный регламент на производство «Ремелтоп», порошок для приготовления суспензии для приема внутрь.

Заключение

Разработанная методика качественного и количественного анализа метилурацила и метронидазола методом ВЭЖХ может быть использована для оценки качества экспериментального препарата «Ремелтоп», порошка для приготовления суспензии для приема внутрь, так как экспериментальным путем установлены параметры линейности (R2=0,9991 при y=233600×x-19,458; R2=0,9993 при y=7490576×x+0,246), диапазона применения (от 50 до 150 %), прецизионности в условиях повторяемости (RSD = 0,50 %; 1,04 %), правильности (=95,52±0,56 %, 99,96±0,16 %) для метилурацила и метронидазола соответственно, которые не превышают рекомендуемых значений.

Рецензенты:

Федосеева Людмила Михайловна, доктор фармацевтических наук, профессор, зав. кафедрой фармацевтической химии с курсом органической и токсикологической химии ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Барнаул.

Лампатов Вячеслав Витальевич, доктор биологических наук, профессор кафедры фармакологии ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Барнаул.