Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,006

STUDY OF ANTHOCYANIN GRAPE-CULTURAL METHODS OF USING HPLC AND MALDI / TOF / MS

Novikov O.O. 1 Pisarev D.I. 1 Zhilyakova E.T. 1 Levchenko V.E. 1 Kazakova V.S. 1 Popov N.N. 1 Fadeeva D.A. 1
1 FGAOU VPO Belgorod State National Research University
The article presents the results of the chemical analysis of grape- cultural . It is known that the grape is one of the oldest plants used by man. One of the most important groups of compounds are grape anthocyanins constitute natural colors with a wide spectrum of pharmacological activity. Information about the composition of an-thocyanins in grape- literary sources differ. Therefore, the present study investigates the composition of this group of compounds in the selected object . The composition of anthocyanins studied with the assistance of one of the most objective analysis methods - high performance chromatography and mass spectrometry in the form MALDI / TOF / MS. Using these methods could decipher the structure of anthocyanins that are part of the fruit of grapes. Found that only 9 in fruit anthocyanin compounds structure , with the highest percentage accounts for malvidin glycosides . The use of RP-HPLC method for the analysis of anthocyanins was useful for individual characteristics and quantify the components of the studied object. Using MALDI / TOF / MS proved to be important for the group characteristics of anthocyanins when necessary to confirm the presence of the desired components in the object.
mass spectrometry profile
mass spectrometry
gradient elution
RP-HPLC
anthocyanins
grapes cultural

Виноград культурный (VitisviniferaL.) – одно из древнейших растений, используемых человеком. Лечение виноградом (ампелометрия) известно с глубокой древности. V. viniferaL. оказывает тонизирующее, бактерицидное, мочегонное, слабительное, повышает мышечный тонус, особенно сердечной мышцы. V. viniferaL. эффективен при хронических заболеваниях желудка, кишечника, печени, желчного пузыря и желчевыводящих путей, лёгких, анемии, гипертонии, подагре [1, 2].

Одной из наиболее ценных групп действующих веществ плодов V. viniferaL. являются антоцианы, обладающие широким спектром фармакологической активности [4]. Сведения о составе антоцианов V. viniferaL. встречающиеся в литературе достаточно противоречивы. Поэтому целью настоящего исследования явилось изучение антоцианов V. viniferaL. с помощью методов ОФ ВЭЖХ и MALDI/TOF/MS, как одних из наиболее объективных методов анализа.

Для выделения суммы антоцианов из плодов V. viniferaL. использовали способ выделения антоцианов с помощью сорбции на тальке [3].

Хроматографические исследования проводили на хроматографическом приборе фирмы «AgilentTechnologies 1200 Infinity» производства США cавтоматическим пробоотборником Agilent 1200, вакуумным микродегазатором, градиентным насосом и термостатом той же серии. Электронные спектры поглощения регистрировали с помощью спектрофотометрического детектора с диодной матрицей серии Agilent 1200 (диапазон длин волн от 190 до 950 нм, кювета с длиной оптического пути 10 мм; объемом 13 мкл), шаг сканирования - 2 нм.

Для регистрации и обработки спектральных данных и хроматограмм использовали программное обеспечение «AgilentChemStation».

Для испытаний использовали стальную хроматографическую колонку, AscentisexpressC182,7μм × 100 мм × 4,6 мм.

Антоцианы подвергали хроматографическому разделению в следующих условиях: подвижная фаза: (А) – водный раствор кислоты ортофосфорной (рН ~ 2), (Б) – ацетонитрил или 0,5%-ный водный раствор кислоты уксусной (А) – ацетонитрил (Б) в градиентном режиме элюирования; скорость подвижной фазы – 0,5 мл/мин; температура колонки +35 оС; объём вводимой пробы 1 μl.

Состав подвижной фазы программировали в условиях, указанных в таблице 1.

Таблица 1 - Условия градиентного элюирования антоцианов

Время, мин

А,%

Б,%

0

90

10

10

80

20

20

70

30

30

50

50

40

10

90

Детектирование осуществляли при 520 нм.

Результатом хроматографического разделения суммы антоцианов V. viniferaL.методом ОФ ВЭЖХ явилось установление наличия 8 компонентов антоциановой структуры (рисунок 1).

Описание: E:\Vitis good\510 nm.jpg

Рисунок 1 - Хроматограмма суммы антоцианов плодов V. viniferaL.

(детекция диодно-матричная, λ = 510 нм)

Показатели пригодности хроматографической системы, рассчитанные по результатам хроматографирования, представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Показатели пригодности хроматографической системы для определения антоцианов V. viniferaL.

tR

S

N

HETP

Rs

Tf

Wb

3,817

362,6

13501

7,4

-

1,427

0,1314

6,244

605,6

35212

2,8

18,35

1,734

0,1331

7,715

1141,2

53116

1,8

11,0

1,94

0,1339

8,322

8323,4

54340

1,8

4,4

0,861

0,1428

16,966

5762,6

425806

0,23

1,6

0,548

0,104

tR- абсолютное время удерживания, S - площадь пика, N - число теоретических тарелок, HETP - высота, эквивалентная теоретической тарелке, Rs- коэффициент разделения пиков, Tf - коэффициент асимметрии, Wb - ширина пика на базовой линии

Результаты расчёта критериев эффективности (N>5000, Rs>1,5, Tf<2) [5] свидетельствуют о пригодности использованной системы для анализа антоцианов V. viniferaL.

Регистрацию масс-спектров проводили на приборе масс – спектрометр «AutoflexII» (модификация Microflex) «MALDITOF/TOF» (приборная ошибка - не более 0,5 Da) фирмы BrukerDaltonicsGmbH производства Германии.

Анализируемую пробу в количестве 0,5 μl с помощью дозатора наносили на мишень «MTP 384 targetplatemattsteelTF», высушивали и сверху наносили каплю матрицы. В качестве матрицы использовали α-цианокоричную кислоту (НССА), регистрацию спектров вели с помощью программы «FlexControl», обработку данных осуществляли в программе «FlexAnalis», в отражённом режиме при положительной полярности (ReflexPositive).

Масс-спектрометрический профиль антоцианов плодов V. viniferaL.показал присутствие пиков молекулярных ионов с зарядами m/z = 463,187, m/z = 479,161, m/z = 493,201, m/z = 609,158, m/z = 625,143, m/z = 639,158, соответствующих монозидным и дигликозидным формам антоцианов. При фрагментации образуются агликоны, молекулярные пики ионов которых имеют заряды m/z = 301,306, m/z = 317,313 и m/z = 331,544, соответствующие пеонидину, петунидину и мальвидину. Для мальвидина и его гликозида можно выделить характерный признак присутствия в спектре в деметилированном состоянии: m/z = 345[C17H15O6]-14[СН2] = 331, та же картина наблюдается в случае гликозида (рисунок 2).

Описание: G:\Vitis\vitis 5.bmp

Рисунок 2 - Масс-спектр антоцианов плодов V. viniferaL.

Результаты анализа плодов V. viniferaL.представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Результаты анализа антоцианов в плодах V. viniferaL.

tR, мин

Содержание антоцианов в сумме, %

Молекулярная масса

m/z

Идентифицированный компонент

4,01

3,16

463

Пеонидин-3-глюкозид

-

-

610

Пеонидин-3-рутинозид

7,42

9,8

479

Петунидин-3-глюкозид

9,20

7,9

625

Петунидин-3-рутинозид

10,48

52,0

493

Мальвидин-3-глюкозид

16,13

5,0

639

Мальвидин-3-рутинозид

18,04

2,4

301

Пеонидин

19,36

3,7

317

Петунидин

19,818

16,1

331

Мальвидин

Таким образом, в ходе настоящего исследования с помощью методов ОФ ВЭЖХ и MALDI/TOF/MS удалось обнаружить присутствие 9 антоцианов, гликозидов мальвидина, пеонидина и питунидина. Причём использование метода ОФ ВЭЖХ при анализе антоцианов оказалось полезным для индивидуальной характеристики и количественной оценки компонентов в изученном объекте. Использование MALDI/TOF/MS оказалось важным для групповой характеристики антоцианов, когда необходимо подтвердить присутствие искомых компонентов в объекте.

Рецензенты:

Шомаров В.К., д.фарм.н., профессор кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета, г.Курск.

Будко Е.В., д.фарм.н., профессор кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета, г.Курск.