Введение
Исследования генетики запасных белков пшеницы и связь их с качеством муки показало, что на качество влияют как глютелины, так и глиадины зерна [9, 10]. Это основные белковые компоненты эндосперма, формирующие качество выпечки за счет создания белкового каркаса, поддерживающего ее форму. В агрегации белкового комплекса участвуют различные связи. В то же время, не все из них одинаково важны для формирования качества. Так, водородные связи, участвующие в агрегации белков теста, при нагревании разрушаются и, соответственно, мало влияют на форму конечного продукта. В этом отношении большего внимания заслуживают дисульфидные связи, обладающие достаточной стабильностью при высокой температуре.
Целью работы было исследовать влияние вариантов глиадинов на образование дисульфидных связей в белковом комплексе муки пшеницы и определить аллели глиадинкодирующих локусов с положительным вкладом в их формирование.
Материал и методы исследования
Исследовались сорта и селекционные формы мягкой пшеницы конкурсного испытания ГНУ Белгородского НИИСХ Россельхозакадемии урожая 2008 года. По климатическим характеристикам этот год был близок к среднемноголетним для Белгородской области [4]. Данные условия наиболее благоприятны для дифференциации технологических особенностей между образцами пшеницы [3–5].
Электрофорез глиадинов эндосперма зерновки выполнялся в ГНУ ВНИИС и ЗК Россельхозакадемии (Зерноград) в крахмальном геле с использованием алюминий лактатного буфера рН 3,1 по методике Созинова и Поперели [7]. Идентификацию аллелей глиадинкодирующих локусов вели в соответствии с символикой обозначения Поперели [10].
Число дисульфидных связей в белковом комплексе зерна определялось с помощью показателей седиментации муки 30 % выхода в соответствии с прописью Нецветаева и др. [3, 5]. Количество дисульфидных связей навески муки относили на процент сухой клейковины данного образца. Индекс деформации клейковины (ИДК) определяли на приборе ИДК-1 в соответствии с инструкцией [6].
Выборки из конкурного испытания для сравнения формировали в соответствии с данными электрофоретического анализа. Оценку существенности различий между полученными выборками вели по критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Ранее показано [3–5], что оценка количества дисульфидных связей белкового комплекса муки отражает физические свойства клейковины зерна пшеницы. Так, в 2008 году корреляция между индексом деформации клейковины (ИДК) и числом дисульфидных связей белкового комплекса составила –0,46 (n=74, p>0,999). Следовательно, в этом году показатель ИДК на 21 % определялся степенью агрегации белков с помощью -S-S- связей. Очевидно, другие связи также играли определенную роль в формировании физических свойств клейковины. Стандартный показатель седиментации, по Пумпянскому-Созинову [6], не обнаружил существенной связи с величиной ИДК (r=-0,11; n=74; p<0,95) [3-5]. В то же время SDS седиментация показала значимую корреляцию с ИДК клейковины (r=-0,32; n=74; p>0,99), что может свидетельствовать о сопряженности в 2008 году данного показателя с физическими свойствами клейковины на уровне 10 %.
Известно, что качество муки зависит от компонентного состава запасных белков эндосперма пшеницы [9, 10]. Предыдущие исследования [3, 5] показали, что число дисульфидных связей связано с вариантами глиадина. В связи с этим, были исследованы варианты глиадина в образцах зерна, некоторые из которых представлены на рис. 1.
Рис. 1 . Электрофореграммы глиадина сортов А) Богданка (1), Уни 1 (2-3), 6/08 (4), 8/08 (5), 13/08 (6-7); Б) Синтетик (1-3) и № 95/08 (4-5)
Это позволило оценить вклад аллелей локусов, контролирующих синтез глиадинов, в формирование межцепочечных -S-S- связей. Для этого провели группировку образцов (табл.) в соответствии с вариантами белков, контролируемых соответствующими аллелями 6 локусов, и оценили средние значения по числу дисульфидных связей.
Таблица
Оценка вклада аллелей глиадинкодирующих локусов (или тесно сцепленных с ними генов) на уровень формирования –S-S-связей белкового комплекса эндосперма
|
Символы аллелей Gld локусов |
Количество образцов |
Количество межмолекулярных дисульфидных связей, усл. ед. |
Отклонение от средней (+), мл/%(сух.клейк) |
|
Хромосома 1А |
|||
|
А2 |
20 |
4,40 + 0,31 |
+0,95 |
|
А3 |
10 |
3,36 + 0,57 |
-0,09 |
|
А4 |
28 |
3,04 + 0,36 |
-0,41 |
|
А12 |
5 |
3,06 + 1,16 |
-0,39 |
|
А17 |
4 |
2,35 + 0,63 |
-1,1 |
|
Среднее |
Σ67 |
3,45 |
- |
|
Хромосома 1В |
|||
|
В1 |
53 |
3,91 + 0.23 |
+0,46 |
|
В3 |
8 |
0,78 + 0,64 |
-2,67 |
|
В4 |
3 |
2,54 + 0.85 |
-0,91 |
|
Среднее |
Σ 64 |
3,45 |
- |
|
Хромосома 1D |
|||
|
D1 |
11 |
3,94 + 0,41 |
+0,58 |
|
D2 |
10 |
3,82 + 0,52 |
+0,46 |
|
D4 |
10 |
3,07 + 0,71 |
-0,29 |
|
D5 |
29 |
3,02 + 0,34 |
-0,34 |
|
D7 |
4 |
3,84 + 1,04 |
+0,46 |
|
Среднее |
Σ 64 |
3,36 |
- |
|
Хромосома 6А |
|||
|
6А1 |
8 |
3,19 + 0,49 |
- 0,25 |
|
6А3 |
59 |
3,49 + 0,26 |
+ 0,04 |
|
Среднее |
Σ 67 |
3,45 |
- |
|
Хромосома 6В |
|||
|
6В1 |
31 |
3,18 + 0,38 |
- 0,27 |
|
6В2 |
36 |
3,69 + 0,29 |
+ 024 |
|
Среднее |
Σ 67 |
3,45 |
- |
|
Хромосома 6D |
|||
|
6D1 |
38 |
3,41 + 0,33 |
- 0,04 |
|
6D2 |
29 |
3,55 + 0,33 |
+ 0,10 |
|
Среднее |
Σ 67 |
3,45 |
- |
Как видно, варианты пептидов, контролируемые разными аллелями, обладают не одинаковой способностью к межмолекулярной агрегации в белковый комплекс с помощью дисульфидных связей. Так, например, если вариант GLD 1A2, контролируемый аллелем Gld 1A2 хромосомы 1А, связан с положительным эффектом в образовании дисульфидных связей, то альтернативный вариант пептидов GLD 1A17, контролируемый аллелем Gld 1A17 (рис. 1), приводит к негативному влиянию на агрегацию пептидов. Различия по эффекту образования дисульфидных связей белкового комплекса между этими вариантами существенны (рис. 2, t=2,1; n=24; p>0.99). Характерно, что вариант GLD 1A17 связан с интрогрессией в геном пшеницы генетического материала от ржи [2]. Этот вариант известен также под символом GLI A1w (аллель Gli-A1w), согласно обозначению Kozub et al. [8].
Подобными эффектами обладают также варианты пептидов, контролируемые другими локусами. Так, если вариант GLD 1B1, контролируемый аллелем Gld 1B1 локуса Gld 1B расположенного в коротком плече хромосомы 1В определяет положительное влияние на образование дисульфидных связей в белковом комплексе зерна (табл., рис. 2), то вариант GLD 1B3, обусловленный альтернативным аллелем Gld 1B3, приводит к негативному эффекту.
Хромосома 1А
←--------------- 2,1** --------------→
←------1,3 ------→ ←------ 0,8 ------→
←-- 1,0-→ ←- 0,3 -→ ←-0,1-→ ←--0,7--→
А2 (4,4) ≥ A3 (3,4) ≥ A12 (3,1) = A4 (3,0) ≥ A17 (2,35)
←------ 0,4------→
←------------1,4 ----------→
←---------- 1,1----------→
Хромосома 1В
←------3,1***------→
B1 (3,9) ≥ B4 (2,5) ≥ B3 (0,8)
←-- 1,4-→ ←-- 1,7-→
Хромосома 1D
←--------------- 0,9 -------------→
←------0,1 ------→ ←----- 0,8 -----→
←-- 0,1-→ ←- 0,0-→ ←-0,7-→ ←--0,1--→
D1 (3,9) = D7 (3,8) = D2 (3,8) ≥ D4 (3,1) = D5 (3,0)
←------ 0,7 ------→
←-----------0,8-----------→
←----------0,8----------→
Хромосома 6А
А3 (3,5) ≥ A1 (3,2)
←- 0,3 -→
Хромосома 6В
B2 (3,7) ≥ B1 (3,2)
←- 0,5 -→
Хромосома 6D
D2 (3,6) = D1 (3,4)
←- 0,2 -→
Рис. 2. Вклад аллелей в уровень содержания межмолекулярных дисульфидных связей белкового комплекса, мл/% (сух.клейк) (различия существенны при уровнях значимости: * - 95%, ** - 99%, *** - 99,9% для критерия t)
Различия по вкладу в формирование -S-S- связей в 2008 году между этими вариантами белков были существенны (рис. 2; t=3,1; n=61, p>0,999). Следует отметить, что в этом случае негативный эффект на агрегацию был также связан с транслокацией от ржи, но в хромосому 1В [1]. Генетический фактор Gld 1B3, контролирующий ржаной вариант пептидов GLD 1B3 (рис.1), расположен в транслоцированном от ржи участке хромосомы 1В.
Различия по вкладу аллелей локуса Gld 1D в формирование дисульфидных связей белкового комплекса менее значимы (табл., рис. 2). Еще меньшее влияние на агрегацию белков оказывали глиадинкодирующие аллели локусов, расположенных в шестых группах сцепления (табл., рис. 2).
Характерно, что близкие генотипы по Gld-локусам с наличием активных аллелей по 1D хромосоме: Gld 1A2.1B1.1D5.6A3.6B2.6D2 (n = 3) и Gld 1A2.1B1.1D2.6A3.6B2.6D2 (n = 3) в среднем характеризовались наличием межмолекулярных дисульфидных связей в 4,44+0,26; и 4,39+0,10 усл. ед. Следовательно, они практически не отличались между собой. В то же время генотип с аллелями Gld 1A2.1B1.1D0.6A3.6B2.6D2 (рис. 1, 2–3 дорожки), имевший неактивный аллель – gld 1D0 в 1D хромосоме, приводил к увеличению этих связей в белковом комплексе зерна до 7,38 усл. ед. Характерно, что глиадины, контролируемые 1D хромосомой, не образуют межмолекулярных дисульфидных связей, так как добавление в экстрагирующий раствор восстановителей (β-мерпатоэтанола или дитиотриитола) не изменяет подвижности полипептидов этих глиадинов при электрофорезе и не увеличивает их эктрагируемости. Это свидетельствует об отсутствии цистеиновых остатков у этих белков, которые могли бы участвовать в агрегации полипептидов за счет межмолекулярных связей. Интересно, что в данном случае активизировалась активность аллеля Gld 1B1 в виде увеличения интенсивности полипептидов GLD 1B1 (рис. 1). Реакция этих белков на β-мерпатоэтанол свидетельствует о наличие у них дисульфидных связей.
Таким образом, присутствие глиадинов GLD 1D привело к уменьшению результирующего количества дисульфидных связей в белковом комплексе муки на 2,96 усл. ед. или на треть.
Вегетационный период 2009 г. отличался засушливыми условиями во время формирования и созревания зерна, что способствовало укреплению клейковины. В результате генотип с аллелями Gld 1A2.1B1.1D0.6A3.6B2.6D2 по наличию межмолекулярных дисульфидных связей характеризовался величиной в 6,25 усл. ед., а формы с аллелями Gld 1A2.1B1.1D5.6A3.6B2.6D2, соответственно, - 5,43+0,83 усл. ед. Следовательно, в условиях, способствующих формированию межмолекулярных пептидных агрегатов, отсутствие глиадинов GLD 1D привело лишь к 15 % увеличению количества дисульфидных связей. Это свидетельствует о том, что наиболее эффективно тестировать белковый комплекс эндосперма на количество дисульфидных связей в годы менее благоприятные для формирования высококачественной клейковины.
Оценка физических свойств клейковины между контрастными по количеству дисульфидных связей белкового комплекса образцами в 2008 году показала, что генотипы с аллелем Gld 1B3 (n=8) имели более высокий индекс деформации клейковины (ИДК) по сравнению с генотипами, несущими аллель Gld 1B1 (n=52). Так, носители аллеля Gld 1B3 по этому показателю характеризовались величиной ИДК в 92,0+1,9 ед., а образцы, c альтернативным аллелем Gld 1B1, имели ИДК, равный 78,9+1,2 ед. Различия существенны при p>0,999 (n=60, t=4,94). Следовательно, генотипы, несущие вариант ржаного белка GLD 1B3 (рис. 2), имели более слабую клейковину по сравнению с пшеничными вариантами, что обусловлено слабой агрегацией между ржаными и пшеничными пептидами. Подобная картина наблюдалась с генотипами, несущими ржаной вариант белка GLD 1A17 (рис. 1), контролируемый глиадинкодирующим локусом в транслокации от ржи в коротком плече хромосомы 1А.
Выводы
Таким образом, вариантный состав запасных белков эндосперма пшеницы определяет способность полипептидов агрегироваться с помощью дисульфидных связей. Степень агрегации белков формирует вязкость клейковины (индекс деформации), что определяет ее качество. Установлено, что присутствие белков ржи в зерне пшеницы уменьшает число дисульфидных связей между полипептидами и ухудшает физические свойства клейковины. Наибольшему числу образования дисульфидных связей белкового комплекса среди изученных образцов мягкой пшеницы способствовали следующие генетические факторы, ответственные за синтез глиадинов: Gld 1A2. 1B1. 1D1. 6A3. 6B7. 6D2.
Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы. Соглашение №14.132.21.1323.
Рецензенты:
Сорокопудов В. Н., д.с.-х.н., профессор, профессор кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», г. Белгород.
Смирнова Л. Г., д.б.н., профессор, заведующая лабораторией адаптивного растениеводства и агроэкологии ГНУ «Белгородский НИИСХ Россельхозакадемии», г. Белгород.